图1外泌体
一外泌体提取方法比较
1.1常用的外泌体分离方法
常用的外泌体分离方法超速离心，这种方法非常耗时耗力且需要一台超速离心机。例如还有其他的一些方法，免疫亲和，超滤法，化学聚合沉降法和凝胶过滤层析（size-exclusionchromatography，SEC）（图1）。
Table1：外泌体的提取方法比较
那么方法不同还有这么大的差异，我该如何选呢？从上面的各个角度的研究看，超速离心（UC）方法最适合蛋白质组学研究，然而超速离心+SEC的方法更适合靶向的蛋白质组学研究，而单独使用SEC的方法很明显有较多的血清蛋白污染，对于研究外泌体蛋白组来说，有诸多不便，但是这种方法能够保留较多的外泌体蛋白量，更适合进行外泌体中RNA分析。
到目前为止，仍没有一种提取方法能同时保证外泌体的含量、纯度以及生物活性。
离心法
这是目前外泌体提取最常用的方法。简单来说，收集细胞培养液以后依次在g、g、g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后0g离心得到外泌体。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。
过滤离心
过滤离心是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜离心分离外泌体。截留相对分子质量是指能自由通过某种有孔材料的分子中最大分子的相对分子质量。外泌体是一个囊状小体，相对分子质量大于一般蛋白质，因此选择不同大小的MWCO膜可使外泌体与其他大分子物质分离。这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。
密度梯度离心法
密度梯度离心是将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法。用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无*，在高浓度时粘度不高且易将pH调至中性。实验中常用蔗糖密度梯度离心法，在离心法的基础上，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5M和0.25M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，0g离心16h，外泌体会沉降到等密度区(1.10~1.18g/ml)。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。
免疫磁珠法
泌体相关抗原的抗体(如CD9、CD63、Alix)与外泌体共同孵育，蒸馏水冲洗后，重悬于PBS缓冲液中。这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备,但是非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行下一步的实验。
色谱法
色谱法是利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。样品中大分子不能进入凝胶孔，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先被流动相洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到更强地滞留，更慢地被洗脱出。分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。
1.2.外泌体测量各种方法的比较
电子显微镜
扫描电子显微镜(SEM)的工作原理是以能量为1-30KV间的电子束，以光栅状扫描方式照射到被分析试样的表面上，利用入射电子和试样表面物质相互作用所产生的二次电子和背散射电子成象，获得试样表面微观组织结构和形貌信息，并且具有较高的分辨率。由于超高真空技术的发展，场发射电子枪的应用得到普及，现代先进的扫描电镜的分辨率已经达到1纳米左右，足够用来进行外泌体尺寸的测量。鉴于SEM的工作特点，在外泌体研究中，能够直接观察到样品中外泌体的形态。并且SEM具有很高的分辨率，能够鉴别不同大小的外泌体。但SEM对样品的预处理和制备上面要求较高，样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量快速的测量。而且由于外泌体经过了预处理和制备过程，无法准确的进行外泌体浓度的测量。
动态光散射技术
动态光散射是收集溶液中做布朗运动的颗粒散射光强度起伏的变化，通过相关仪？器将光强的波动转化为相关曲线，从而得到光强波动的速度，计算出粒子的扩散速度信息和粒子的粒径。小颗粒样品的布朗运动速度快，光强波动较快，相关曲线衰减较快，大颗粒反之。
在外泌体研究中，动态光散射测量敏感度较高，测量下限为10纳米。相对于SEM技术来说，样品制备简单，只需要简单的过滤，测量速度较快。但由于动态光散射技术是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。
纳米微粒追踪分析术
纳米微粒追踪分析术(以下简称NTA)是一种比较新颖的研究纳米颗粒的方法，可以直接和实时的观测纳米颗粒。NTA通过光学显微镜收集纳米颗粒的散射光信号，拍摄一段纳米颗粒在溶液中做布朗运动的影像，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学半径和浓度。
NTA系统的工作原理是将一束能量集中的激光穿过玻璃棱镜对样品(悬浮颗粒的溶液)进行照射激光光束从较小角度入射进入样品溶液，照亮溶液中的颗粒。配备相机的光学显微镜，被放置在特定的位置上，收集视野中被照亮的纳米颗粒发射出的光散射信号。样品池有大约微米的深度，采样点激光照亮宽度为20微米，这个数值和光学显微镜的聚焦的视野深度相匹配。相机会进行60秒的影像拍摄，每秒30个采样画面。颗粒的运动过程被NTA软件进行分析。NTA软件在每幅被记录的画面中鉴别和追踪做布朗运动的纳米颗粒。
根据颗粒的运动速度，通过二维Stokes-Einstein方程计算颗粒流体力学半径
在方程中2是均方位移，KB是Boltzmann常数;T是溶液的温度，单位是Kelvin;ts是采样时间，例如，1/30fpsec=33msec；η是溶液粘度；dh是流体力学直径。NTA检测颗粒大小的范围和颗粒本身的折光指数相关。测量的下限取决于被研究颗粒和背景之间信噪比，也就是颗粒的散射光强度和背景的光强差距。颗粒的散射光强度根据Rayleigh散射方程，受到以下因素的影响，其中，d是颗粒的直径，λ是入射光的波长，n是颗粒和溶液的折光系数比。通常来说，生物样品，如外泌体等，折光系数较低，所以测量下限为30-40纳米。
由于直接追踪样品中每一个纳米颗粒，因此NTA技术对复杂的样品具有极高的分辨率。为了证明NTA对于复杂样品的分辨能力，我们将纳米和纳米两种不同大小的聚苯乙烯颗粒按照5:1的数量混合，使用NTA进行测量。尽管其分布图形有一定的重叠，但两种不同大小的纳米颗粒的峰清楚的区分开来。这种对复杂样品的分辨能力对于外泌体这样的研究对象来说是非常重要的。
NTA也能对样品浓度进行直接测量。对一系列浓度为1×-8×的纳米单分散样品进行测量，可以看到NTA测量浓度结果和实际浓度存在着很好的线性相关。对于多分散体系，测量结果的准确取决于仪器参数的设定(照相机快门速度和光圈)，恰当的参数设定可以保证不同大小颗粒都能被NTA软件追踪和计算。
NTA还具有分析荧光样品的能力。NTA有四种不同波长的激光器可以选择，包括纳米,纳米,纳米和纳米的激光器，再搭配相应的滤光片，即可实现对荧光样品的测量。将纳米的荧光标记的颗粒和纳米的非荧光颗粒用同一溶剂做成混合样品，使用NTA进行测量。蓝色的线显示为NTA的光散射模式，可以看到尽管纳米和nm纳米颗粒的分布图有重叠，但还是清楚的区分了纳米和纳米的峰值。然后使用荧光滤光片进行分析，只观测到纳米的荧光标记的纳米颗粒(红线)
由于外泌体表面有标志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在复杂的背景环境下(如血清中)，可以用荧光抗体标记外泌体，再用NTA的荧光测量功能实现在复杂背景下对外泌体的测量。相比较于流式细胞仪的荧光功能，NTA分辨率较高，且测量荧光颗粒的下限可以达到30-40纳米，而流式细胞仪的测量下限为纳米。即使对于最新一代的数码流式细胞仪，其测量下限已经达到纳米，但由于它仍然建立在监测光信号的基础上，所以测量和准确性和分辨率仍然不可靠。所以在外泌体荧光功能测量上，NTA具有独特的优势。
1.3.总结
对外泌体作为生物标志物的研究目前仍处于起步阶段，但其在临床应用领域已显示出良好的前景。在临床诊断中，若想在复杂的生物背景下(如血浆，尿液)简单快速地测量外泌体浓度，需具备外泌体的大小和表征数据。但目前存在的方法都无法完美的解决这一问题。作为一个相对新的测量技术，NTA具有较高的分辨率，提供实时观测以及准确的浓度测量和荧光测量，对外泌体大小和浓度研究提供了新的思路。
2.外泌体的检测与分析和应用
外泌体的检测与分析
外泌体的分析方法大致可分为2种。
一种是从体液及细胞培养液中提取外泌体，对由外泌体运输的蛋白质、脂质及RNA进行分析的方法。
另一种则是直接在体液中检测分析外泌体的方法。外泌体被细胞吞食及分泌的具体过程，需借助荧光显微成像系统进行观察及分析。
使用体液及细胞培养液的分析方法
通常情况下，要从血液、腹水等体液样本中分离提纯外泌体，会采用超离心、超过滤等方法。但是，用此类方法提取到的外泌体，会混入性状、浓度相近的其他粒子、高质量蛋白质等杂质，很难单独分析外泌体。
为了解决这一问题，有时也会配合使用亲和纯化*1技术。为了确认最终分离提纯所得的样本是否为外泌体，还会借助动态光散射法及显微镜，进行尺寸核实与蛋白质印迹*2。
*1：亲和纯化（affinitypurification）
利用能够与目标分子进行特异性可逆结合的分子（配体）反应，对目标分子、蛋白质或相应复合体实施分离提纯的方法。
*2：蛋白质印迹法（westernblotting：WB）
一种用于了解蛋白质特性的基础实验方法，可用于测量在外泌体中表达的蛋白质。
直接通过体液进行检测、分析的方法
人们正在研究无需分离提纯外泌体，直接在体液中进行检测的方法，例如，常被用于癌症治疗领域的，“流式细胞光度术*3”、“微阵列分析”、“表面等离子共振”等等。除此以外，还有以大肠癌诊断为目的的ExoScreen法。
不同于利用内窥镜及穿刺针采集肿瘤组织的传统活检（biopsy），以血液等体液为样本，实施诊断及治疗效果预测的“液体活检（liquidbiopsy）”，已经成为了一种备受期待的新兴早期发现技术。
*3：流式细胞光度术（flowcytometry）
利用以激光照射细胞及微粒时产生的散射光或荧光，对粒子特性进行评估的技术。能够同时对单种细胞（细胞、细菌等）的多项特征进行高速测量。适用于评估外泌体的蛋白质表达量及其进入细胞内部的情况。虽然难以进行定量分析及囊泡种类的区分，却是一种能够观察细胞内吞外泌体过程的极简便方法。
采用荧光显微成像系统的观察分析
外泌体的直径约为30nm至nm，很难用光学显微镜观察。使用电子显微镜则要面临繁琐的制样操作、真空和电子束导致变质的问题，物性测量也并不常见。最关键的是，电子显微镜并非适用于所有设施。
而利用荧光显微成像系统观察外泌体，则能借助荧光标记实现外泌体的可视化，进行跟踪观察。可以用荧光色素对提取到的外泌体中所含的RNA（RNA运输物）或外泌体膜进行染色，实现可视化观察。
借助上述方法，可以对外泌体的经时分布变化，外泌体的细胞间信息传递过程（即细胞内吞外泌体的情况）进行监控。荧光显微成像系统能够进行其他方法难以实现的观察，例如观察外泌体变化及相应过程等，作为一项可实现更高精度分析的新技术而备受
