众所周知，目前我们实验中常涉及的荧光定量PCR多为单重，即一对引物在单次反应中扩增单个碱基。但是针对于多样本或多靶标基因的检测，单重荧光定量PCR耗时费力、无法排除不同样品孔间的加样差异，显然已经不再适用，此时，将会引入一种新的扩增方法—多重荧光定量PCR—即多重qPCR。
提到多重qPCR，有些小伙伴可能比较熟悉，有些小伙伴可能只知其然，不知其所以然。通过本文为大家整理了多重qPCR探针的选取及其应用，一起出发来看看吧！
什么是多重qPCR？
想要了解多重qPCR的原理，要先从多重PCR了解可能会更加容易。
多重PCR(multiplexPCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对或以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同,但不是单一PCR的简单混合，常受到反应体系和反应条件的各种因素影响。
图1.多重PCR原理
多重qPCR也是在一管内完成多个目标基因的检测，要区分这些目标基因的荧光信号，通过SYBRGreenI染料标记扩增产物就无法实现，因此常用探针法来进行多重qPCR，即针对每一个目标基因，设计特异性探针，利用不同探针上标记的荧光基团，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测。
多重qPCR常用的探针
多重qPCR常用的2种探针为：TaqMan水解探针、分子信标探针。
TaqMan水解探针(Hydrolysisprobes)是多重荧光PCR体系中常用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，随着反应的进行，Taq酶的5→3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光信号被从而荧光监测系统接收，发出荧光。
图2.TaqMan探针作用原理
关于TaqMan水解探针的详细解析可以查看往期文章《最全详解修饰引物/探针—TapMan探针》
分子信标(Molecularbeacon)是多重qPCR体系中另一种常用的探针，基于荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)的原理，当体系中不存在特异性的靶标时，分子信标会自发形成茎环结构，淬灭基团与荧光基团相互接近，荧光被淬灭。
如果体系中存在特异性的靶标，在一定的条件下，茎环结构会打开并且与靶标进行复性，从而产生荧光信号。那么在同一个反应体系中加入几种靶标特异性的分子信标就能够实现对多个靶标的同时检测。
图3.分子信标探针的作用原理
设计多重qPCR探针要注意什么？
1.根据荧光定量PCR仪型号，选择荧光基团
荧光基团的选择需要根据荧光定量PCR仪的品牌及型号确定。由于不同品牌及型号的荧光定量PCR仪所发出的激发光和发射光不同，因此需要匹配合适的荧光基团。图4为目前市面上，不同荧光定量PCR仪与荧光基团的兼容性信息，可以看出FAM基团与不同品牌（型号）仪器的兼容性广，因此是大多数多重qPCR策略的首选荧光基团。
如果使用了不适合仪器的荧光组，必须在此之前针对该荧光组对仪器进行校正。目前主流的荧光定量PCR仪仍然可以支持更多通道的多重检测。
图4.常见定量PCR仪和荧光基团的兼容性
2.淬灭基团的选择
淬灭基团的选择，必须要保证其吸收光谱与报告基团的发射光谱有重合。
在确定探针的荧光基团后，还需要根据荧光基团的类型来匹配淬灭基团，多重qPCR不需要选择多个淬灭基团，可以匹配所有荧光基团的淬灭基团最为恰当。例如：在两重qPCR中若选择FAM和VIC作为荧光基团，可以统一选择BHQ-1作为淬灭基团。
此外，需要优化多重qPCR的引物探针序列的特异性，以防止它们相互干扰。确定最佳引物探针比等等。一般情况下，建议极限是不超过4重，超过4重会比较困难。
图5.常用的淬灭基团和报告基团组合
3.避免荧光基团的相互干扰
在多重qPCR中针对不同靶标的检测，需要设计不同的探针、选用不同光谱范围的荧光基团。虽然许多荧光光谱相似的荧光基团的最大发射波长不同，但在附近的波段内，它们仍然会相互重叠。因此，在选择荧光基团时要注意避免荧光基团的发射光谱之间的相互干扰。
图6.不同荧光基团的发射光谱
4.根据荧光强度分配检测靶标
不同荧光基团的荧光强度有高有低。比如FAM是荧光强度相对较高的一组，所以我们更倾向于将其安排给表达相对较低的靶基因，而荧光强度相对较低的一组可以用来检测表达相对较高的看家基因。这样就达到了放大曲线平台的目的，熔解曲线会更漂亮。
多重qPCR的应用
在国际标准分类中，多重qPCR涉及到林业和农业、兽医学、生物学、植物学、动物学、医学科学、食品试验和微生物学等。
在中国标准分类中，多重qPCR涉及到植物检疫、动植物检疫、卫生检疫等场景。
多重qPCR曾应用的实例场景如：高血压用药指导基因检测、脑脊髓炎病毒检测、肿瘤病毒检测等等，应用场景十分广泛，因此也逐渐成为微生物检测、病毒检测、基因分型、肿瘤检测及鉴定等的主流技术之一。
